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标题:
工业酶制剂通用试验方法
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作者:
safety
时间:
2007-7-31 21:54
标题:
工业酶制剂通用试验方法
中华人民共和国轻工行业标准
工业酶制剂通用试验方法
QB/T 1803一1993
General methods of determination
for industral enzymes
1主题内容与适用范围
本标准规定了工业酶制剂的试验方法.
本标准适用于工业酶制剂的检测.
2引用标准
GB 601化学试剂滴定分析(容t分析)用标准溶液的制备
GB 603化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备
GB 604化学试剂酸碱指示剂pH变色域测定通用方法
GB 1250极限数值的表示方法和判定方法
GB 4789.2食品卫生徽生物学检验菌落总数测定
GB 4789.3食品卫生徽生物学检验大肠菌群测定
GB 4789.4食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验
GB 4789.15食品卫生微生物学检验霉菌和醉母数测定
GB 6004试验筛用金属丝编织方孔网
GB 6682实验室用水规格
GB 8170数值修约规则
GB 8451食品添加剂中重金属限f试验法
GB 9721化学试剂分子吸收分光光度法通则(紫外和可见光部分)
3总则和基本要求
3.1总则
3.1.1方法中所采用的名词术语,计量单位应符合国家规定的标准.
3.1.2方法中所用的各种分析仪器(如:分析天平,酸度计,分光光度计和紫外分光光度计等)要按时检
定;所用的滴定管,移液管,容量瓶等器具应按有关检定规程定期校正.
3.1.3方法中所用的"仪器"为试验中所必须使用的特殊仪器,一般实验仪器不再列人.
3.1.4方法中所用的水.在未注明其它要求时,应符合GB 6682中三级(或以上)规格要求.
3门.5方法中所用的试剂,在未注明其它规格时,均指分析纯(A. R).
3.1.6方法中的"溶液",除另有说明外,均指水溶液厂稀释至刻度"是指用水稀释定容至刻度.
31.了同一检测项目,有两个或两个以上试验方法时,各实验室可根据各自条件选用,但以第一法为仲
裁法.
3.1.8理化要求以实测数据报告其试验结果,数据的计算与取舍,遵照GB 8170执行;极限值的判定
中华人民共和圆轻工业部1993-07-29批准1994一03一01实施
QB/T 1803一1993
按G13 1250中修约值比较法进行,结果的有效数字要与技术要求相一致
3.2基本要求
3.2.1测定样品,必须做平行试验
3.2.2标准溶液的浓度,一般采用物质的量浓度,单位为摩尔每升或摩尔每立方米表3J:,如:盐酸标准
溶液〔'(HCl)一..I M01/1〕
3.2.3试验中所用玻璃器皿,用前须以铬酸洗涤液或合成洗涤剂浸泡,用白来水冲洗,再用蒸馏水洗i
净.
12.4试验方法中吸取或称量时的有效数字,表示要求达到的精确度
4外观及气味检查
取固体酶样(或loml.液体酶)2g倒人25mL干燥小烧杯中,置于鼻下先嗅其气味,然后,再目视检
查外观,作好检查记录.
5酶活力的试验方法
酶活力的测定,见附录A(补充件).
6干澡失重的试验方法
61原理
在常残下将试样置于103℃士2℃电热干燥箱中烘干2h,用称量法测定其失去挥发物的质量,以百
分数表示
6.2仪器和设备
6.2门电热干燥箱103 C士2C.
6,2.2称量瓶25mm X 40mm o
6.2.3千燥器以变色硅胶作干操剂
6.2.4分析天平感量.1rng
63分析步骤
用烘干至恒重的称量瓶称取酶样约2g,精确至..00028,置于103'C士2℃电热千燥箱中将盖取下,
侧放在称量瓶旁,烘于2h,取出,加盖,放人干燥器中冷却至室温(约30min),称量.
64计算
X=mi-ml x100.'.....……,,..……,....……(1)
m,一m
式中:X-一样品的干操失重% (m/m);
m,一一干燥前,称量瓶加样品的质量,9;
In,一干燥后,称量瓶加样品的质量,9;
功-一称量瓶的质量,9.
所得结果表示至一位小数.
65结果的允许差
平行试验相对误差不得超过0.5%0
了细(粒)度的试验方法
了1原理
取一定量的酶样,用规定的标准筛进行筛分,称量,计算通过标准筛酶样的质量占总取样量的百分
数(或计算N层筛中间物质量占总取样量的百分数)
118
QB/T 1803一1993
了.2仪器和设备
7.2门标准试验筛
SSW 1. 18/0. 630mm GB 6004(相当于原14目)
SSW 0. 80/0. 450mm GB 6004(相当于原20目)
SSW 0. 40/0. 250mm GB 6004(相当于原39目)
SSW 0. 25/0. 160mm GB 6004(相当于原62目)
7.2.2物理天平感量为..2g,
了.3分析步骤
7.3.1称取固体酶样loos,精确至..2g
7.3.2将规定的标准筛装上筛底盘,然后把称好的样品全部转人标准筛上,加盖,振荡筛分5min并不
时敲打筛梆),静置2min,取下上盖,小心将筛上物全部转人到已知质量的烧杯中,用天平称量,按式(2)
计算.
7.3.3洗涤剂用酶按产品标准中粒度规定,采用上,下限双层筛进行筛分,称取双层筛的中间物(即下
层筛的筛上物)质t,按式(3)计算.
了.4计算
,,loo-M,_______d,=一二二二二-- Xluu=1VU-m……,. .... .. ……(2)
luu一
Xz=_m100X100=m... .. .... .. .:(3)
式中:X一一样品的细度,% (m /m) ;
X,—样品的粒度,0 o (m/m) ;
M-筛上物(或中间物)的质量,9;
100—取样量,g=
所得结果表示至整数.
了5结果的允许差
平行试验相对误差不得超过1%,
8容重的试验方法
81原理
量取固体酶样(或液体酶)100mL,在200C,称其质量,计算单位体积酶的质量,即为样品的容重,以
g/mL表示.
8.2仪器和设备
8.2.1恒温水浴20℃士o. 1'C.
8.2.2分析天平感量为..lmgo
8.2.3容量瓶100mL(准确校正过).
8.3分析步骤
用一个洁净,干燥的已知质量的100mL
(20'C)自然地缓缓地注人容量瓶中(不要徽)容量瓶,取下瓶塞,在上口处,放一个三角玻璃漏斗,将酶样
,直至刻度.取下三角漏斗,加盖瓶塞,称t,
8.4
式中
计算
m1一m
二二二一.…,......................……
100
(4)
X一一样品的容重,g/mL;
rn—容量瓶加样品的质量,9;
m—容量瓶的质量,9;
QB/T 1803一1993
100一一取样体积,mL,
所得的结果表示至二位小数.
8.5结果允许差
平行试验相对误差不得超过5%.
9 pH值的试验方法
9.1原理
将指示(玻璃)电极和参比(甘汞)电极浸人被测样液中,构成一个原电他,其电动势与溶液的pH值
有关,通过侧f原电池的电动势即可得出溶液的pH值.
9.2试荆和溶液
9.2.1酒石酸盐标准级冲溶浪用无二氧化破水溶解外消旋的酒石酸氢钾(KHC,H,0, ),并剧烈振摇
至饱和溶液.25℃时,pH=3.56,
9.2.2礴酸盐标准级冲溶液称取礴徽二氮钾(KH,PO,) 3. 40g和碑酸蟹二钠(Na,HPO,) 3. 55g.溶于
无二氧化碳的水中,并稀释至1000mL, 25℃时,pH=6.86,礴酸二氢钾和磷酸红二钠须预先在120℃士
10℃干燥2h,
也可用专供校准用的混合磷酸盐pH缓冲剂(25'C pH=6.864),
9.2.3翻酸盐标准级冲溶液称取四翻酸钠(Na,B,0, " 1OHi0)3.81g,溶于无二氧化碳水中,并稀释
至l 000mL,此溶液浓度c(Na=B,O, " WHO) =0. Olmol/L, 25'C时,pH=9.18.存放时应防止空气中二
氧化碳进人.
也可用专供校准用的翻砂pH缓冲剂(25'C pH=9.18)配制.
9.2.4氢氧化钙标准缓冲溶液于25'C,用无二氧化碳水溶解氢氧化钙制成饱和溶液,其浓度,C1/
2Ca (OH) 2〕应在..0400^-0. 0412mol/L.存放时应防止空气中二氧化碳进入.一旦出现混浊,应弃去重
配.25℃时,pH=12.45,
9.2.5水符合GB 6682中三级水规格.
9.3仪器
9.3.1 pH计分度值为0. 02pH单位并应备有电磁搅拌器.
9.3.2指示(玻确)电极用前须在水中浸泡24h以上,用后应立即清洗,并浸人水中.
9.3.3参比(饱和甘汞)电极使用时电极上端小孔的胶皮塞必须拔出,以防止产生扩散电位,影响测
定结果.电极内抓化钾溶液中不能有气泡,以防止断路.
9.4分析步魏
9.4.1将温度补偿旋钮调至25'C,用接近于被侧溶液pH值的两种标准级冲溶液校正pH计,定位.
9.4.2用水冲洗电极,再用样液洗涤电极,调整样液沮度并将温度补偿调至25C,测定样掖的pH值.
重复测定操作,直到pH值读数德定lmin为止.
所得结果表示至一位小数.
9.4.3结果的允许差
平行试脸之差不得超过0. 1pHo
10洗涤荆用晚翻荆肠解(落娜)时间的试脸方法
10.1原理
称取固体醉样lg,放人一定量的水中,在规定的沮度与搅拌速度下,记录其在水中全部崩解(溶解)
所禽的时间.
10.2仪器
10.2.1恒温水浴30℃士0.20c,
QB/T1803一1993
10.2.2电磁搅拌器(带温控的).
1. 2 3分析天平感量为..lmg.
10.2.4秒表.
10.3分析步骤
称取固体酶样1.o009,精确至..o019,置于事先盛有loomL,30℃士.2℃水的15omL烧杯中,放
人一枚转子,置于30℃电磁搅拌器上,立刻计时,以中速搅拌,记录样品在水中全部崩解(溶解)的时间.
先作预备试验,每隔305,停止搅拌观察一次,记录直至全部崩解(溶解)所需的时间.
正式试验时,根据预备试验的结果,按预侧的时间停止搅拌,观察并记录在水中全部崩解(溶解)的
时间.所得结果表示至秒.
10.4结果的允许差
平行试验之差不得超过305.
1111.1
醉活力保存率的计算方法
11.2
式中
原理
根据标签上标示的醉活力和实侧的醉活力,计算出实洲醉活力为标示醉活力的百分数.
醉活力保存率的计算
__El___
入令二绮XIOO "........... ....... ……, (5)
上二
:X—样品的醉活力保存率,%;
E,—样品的实测醉活力,u/9(u/mL);
E—样品的标示酶活力,u/9(u/mL).
所得结果表示至整数.
卫生要求的检翻
重金属的测定.按GB8451进行.
细菌总数的测定,按GB4789.2进行.
大肠菌群的测定,按GB4789.3进行.
霉菌和醉母菌的侧定,按GB4789.15进行.
沙门氏菌的检验,按GB4789.4进行.
月..八乙气J月叼'
121212121212
QB/T 1803一1993
附录A
酶活力的试验方法
(补充件)
AlAl. 1
a-淀粉酶
定义
Ig固体酶粉(或ImL液体酶),于600C ,pH=6. 0条件,1h液化1g可溶性淀粉,即为1个酶活力单
位,以u/g(u/mL)表示.
Al. 2原理
a一淀粉酶能将淀粉分子链中的.-1,4葡萄糖昔键随机切断成长短不一的短链栩精,少量麦芽糖和
葡萄糖.而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失,呈红棕色,其颜色消失的速度与酶活性有关,故
可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力.
Al-3试剂和溶液
Al. 3.1原碘液称取碘((I,)Ilg,碘化钾(KI)22g,用少量水使碘完全溶解,然后定容至500mi_, r- f
棕色瓶中
Al. 3.2稀碘液吸取原碘液(A l. 3.D2. OOmL,加碘化钾20g用水溶解并定容至500mL,贮于棕色
瓶中A1.3.3 20g/L可溶性淀粉"溶液称取可溶性淀粉(以绝干计)) 2. 000g,精确至.. OOlg,用水调成浆状
物,在搅动下缓缓倾人70mL沸水中,然后,以30mL水分几次冲洗装淀粉的烧杯,洗液并人其中,加热
至完全透明,冷却,定容至lOOmL.此溶液需要当天配制.
注:功采用浙江燕湖食品化工联合公司生产的可溶性淀粉
Al. 3.4磷酸缓冲液(pH =6.0)称取磷酸氢二钠(Na,HPO, " 12Hi0)45.23g,柠橄酸(C6Ha07-
H归)8.07g,用水溶解并定容至10OOmL,配好后用pH计较正.
Al. 4仪器和设备
Al-4-1分光光度计应符合GB 9721的有关规定.
Al. 4.2恒温水浴60C士0. 2 0C.
Al. 4.3秒表
Al. 4.4试管25mm X 200mm .
Al. 5分析步骤
Al- 5.1待测酶液的制备
称取酶粉1-2g,精确_TP, 0. 0002g(或吸取液体酶1. OOmL),先用少量的磷酸缓冲液(Al. 3. 4)溶解,
并用玻璃搅拌棒捣研,将上清液小心倾人容量瓶中,沉渣部分再加人少量缓冲液,如此捣研3-4次.最
后全部移入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度(将估计酶活力除以4,即酶活力应在3. 7^"5. 6n/mL范围
内),摇匀.通过四层纱布过滤,滤液供测定用.
Al. 5. 2测定
Al. 5.2, 1吸取可溶性淀粉溶液(Al-3.3) 20.OmL于试管(Al. 4. 4)中,加人缓冲液(Al. 3-4)
5. OOml,摇匀后,于60-C士0.2C恒沮水浴中预热5min,
Al. 5.2.2加人稀释好的待测酶液(Al. 5,1)l.OO.L,立刻计时,摇匀,准确反应Smin o
Al. 5-2.3立即吸取反应液(Al. 5.2.2)1.OOmL于稀碘液(AL 3-2)5. OOmL中,摇匀,并以稀碘液作
空自,于660nm波长下,用l Omm比色皿,迅速测定其吸光度(A).根据其吸光度查表Al,求得测试酶
液的浓度(c}
Qs/T 1803一1993
吸光度与测试a-淀粉酶酶浓度对照表
吸光度(A)
表A1
1}}t}(c}u)mL}吸光度(A)吸光度CA
酶浓度(口
U一nll'mI
(),100
0.101
0.102
(〕103
0.104
0,105
0.106
0.107
1)108
0. 109
0.110
0.111
0.112
0. 113
0114
0. 115
()'116
0.117
0.118
〔)119
0.120
0.121
〔〕'122
0123
0.124
(),125
0,工26
o. 127
0. 128
0. 129
0.130
0.131
0'132
0. 133
0. 134
0135
0.136
0. 137
0王38
0. 139
0. 140
0141
4. 694
4.689
4.684
4. 679
4.674
4,6右9
4. 664
4. 659
4. 654
4. 649
4. 644
4.639
4. 634
4. 629
4624
4. 619
4. 614
4石Q9
4.604
4.599
4594
4.589
4. 584
4579
4. 574
4.569
4564
4.559
4. 554
4.549
4. 544
4.539
4534
4. 529
4.524
4.518
4.513
0.146
0.147
0.148
0. 149
0.150
0.151
0. 152
0.153
:::
:.;:
507
502
497
492
487
482
'77
0. 156
0.157
0. 158
0. 159
0.160
0.161
0. 162
0.163
0.164
0.165
0.166
0.167
0.168
0.169
0. 170
0.171
Q172
0.173
0. 174
0.175
0. 176
0. 177
0.178
0.179
0.180
0.181
0.182
0. 183
0.184
0.185
0. 186
0.187
0.188
0. 189
吃)飞44172467}0.1900.191
酶浓度(,)
u/mL
4. 462
4457
4452
4. 447
4.442
4.438
4.433
4.428
4.423
4.418
4.413
4.40吕
4.404
4. 399
4.394
4.389
4.385
4.380
4.375
4.370
436弓
4.361
4. 356
4.352
4.347
4.342
4338
4. 333
4. 329
4.324
4.319
4. 315
4.310
4. 306
4.301
429了
4.292
4.288
4.283
4.279
4. 275
4270
4. 266
4. 261
4.257
4.253
0.192
0.193
0.194
0. 195
0.196
0.197
0. 198
0.199
0.200
0.201
0.202
0.203
0.204
0.205
0,206
0.207
0.208
0209
0.210
0.211
0.212
0.213
0.214
0.215
0. 216
0. 217
0.218
0.219
0.220
0,221
0.222
0. 223
0224
0.225
0. 226
0.227
0.228
0. 229
0.230
0.231
0. 232
0,233
.:::
01」:::)
4. 2斗8
牛,244
4.240
4. 235
4.231
4.227
4. 222
4.218
42I4
4. 210
4.205
4. 201
4.197
4. 193
4.189
4.185
4. 181
4176
4. 172
4.168
毒,164
4. 160
4. 156
4.152
4. 148
4. 144
4,140
4.136
4. 132
t. 128
4. 124
4. 120
4.116
4.112
4. 108
4.105
4. 101
4. 097
4.093
4. 089
4. 085
4- 082
4078
4. 074
t.07咤1
弃06了123
Qa/'r 1843一1993
表Al(续)
吸光度(A)
醉浓度(曰
u/mL
4. 063
4.059
4.056
4. 052
4.048
4,045
4.041
4.037
4.034
4.030
4.026
4.023
4.019
4.016
4.012
4.009
4.005
4.002
3.998
3.995
3.991
3. 988
3.984
3.981
3. 978
3.974
3.971
3.968
3.964
3. 961
3.958
3.9S4
3.951
3.948
3.944
3.941
3.938
3.935
3.932
3.928
3. 925
3.922
3.919
3.916
3. 913
3.922
吸光度(A)
醉浓度(')
nlmL
吸光度(A)
醉浓度(曰
ulml
0.238
0. 239
0艺40
0.241
0.242
0.243
0. 244
0.245
0.246
0.247
0.248
0249
0. 250
0.251
0252
0.253
0. 254
0.255
0. 256
0.257
0.258
0.259
0.260
0.261
0262
0.263
0.264
0265
0.266
0.267
0.268
0. 269
0.270
0.271
0.272
6. 273
0.274
0.275
0.276
0.277
0.278
0279
0.280
0. 281
0.282
0,283
0. 284
0.285
0.286
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.:::
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3.钱5l
724
Qs/T 1803一1993
表Al(续)
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:::
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332右
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3.315
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3. 311
3. 308
3.3Of
一一1..一!les.we胜'leell十1一lesl.1.1.十一!lesl一十
125
Qs/T 1803一1993
表A1(续)
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126
QB/T 1803一1993
表A1(完)
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2. 928
2. 927
2. 926
2. 925
2. 923
2. 922
2. 921
2. 920
2. 919
2. 918
2. 917
2. 916
2. 915
2. 914
2. 913
2. 912
2. 911
2. 910
2. 909
2. 908
2. 907
2.906
2. 905
Al. 6
式中
计算
X=cXn ,…(Al
X一一样品的酶活力,u/g(u/mL) ;
.—测试酶液的浓度,u/ml;
n一样品的稀释倍数.
所得结果表示至整数.
127
QB/'r 1803一1993
Al- 7结果的允许差
平行试脸相对误差不得超过2%.
A2箱化蔺
A2.1定义
lg固体酶粉(或1mL液体酶),于400C,pH=4. 6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生lmg葡萄搪,
即为一个酶活力单位,以u/g(u/mL)表示.
A2. 2原理
糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解.-1,4荀萄糖昔键生成葡萄
糖.葡萄糖分子中含有醛蓦,能被次碘酸钠氧化,过t的次碘酸钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准
溶液滴定,计算出醉活力.
A2. 3试剂和溶液
A2. 3. 1乙酸一乙酸钠级冲溶液(pH =4. 6)
称取乙酸钠(CH3000Na " 3H20)6.7g,溶于水中,加冰乙酸(CH,COOH) 2. 6mL,用水定容至
1000mL.配好后用pH计校正.
A2.3. 2硫代硫酸钠标准溶液'(Na2S203)二0. 05mol/L
按GB 601配制与标定.
A2.13碘溶液c(1/212)二0. lmol/L
按GB 601配制与标定.
A2.3.4氢氧化钠溶液'(NaOH) = 0. lmol /L
按GB 601配制.
A2.3.5 200g/L氢氧化钠溶液
称取氢氧化钠20g,用水溶解并定容至100mL,
A2. 3. 6硫酸溶液c (1 /2H,SO,) =2mol /L
量取浓硫酸(密度为1. 84) 5. 6mL ,级级注人80mL水中,冷却后,定容至100mL,
A2.3.7 20g/L可溶性淀粉2)液溶
同Al. 3.3.
注:2)采用浙江婆湖*A化工联合公司生产的可溶性淀粉.
A2.3.8 log/L淀粉指示液
按GB 604配制.或将2鲍/L可溶性淀粉溶液稀释一倍.
A2.4仪器和设备
A2. 4. 1恒温水浴40℃士0. 2'C.
A2. 4. 2秒表.
A2. 4. 3比色管50mL.
A2. 5分析步骤
A2. 5. 1待侧酶液的制备
称取醉粉1-2g,精确至.. oooz8(或吸取液体醉1. OOmL),先用少f的乙酸级冲液(A2. 3. 1)溶解,
并用玻璃搅拌棒捣研,将上清液小心倾入容f瓶中.沉渣部分再加人少f缓冲液,如此捣研3-4次,最
后全部移人容f瓶中,用缓冲液定容至刻度(估计醉活力按表A2相对应稀释倍数,使酶活力在10.一
250u/mL范围内),摇匀.通过四层纱布过滤,撼液供侧定用.
QB/T 1803一1993
表A2
估计璐活力u/g(u/mL)
200-1000
1000--3000
3000--6000
6000^ 10000
10000^-30000
30000^-60000
60000--90000
释倍数
2-5
5-20
20^-30
30^-50
50-200
200-300
300-500
A2. 5. 2测定
A2. 5. 2.1于甲,乙两支50mL比色管中,分别加人可溶性淀粉溶液(A2. 3. 7) 25. OmL及缓冲液
(A2. 3-1) 5. OOmL,摇匀后,于40℃士..2℃恒温水浴中预热5min.在甲管(样品)中加人待测酶液
(A2.5.1)2. OOmL,立刻摇匀,在此温度下准确反应30min,立即各加氢氧化钠溶液(A2. 3. 5)0. 20mL,
摇匀,将两管取出迅速冷却,并于乙管(空白)中补加待侧醉液(A2.5.1)2- OOmL,
A2. 5. 2. 2吸取上述反应液与空白液(A2.5-2-1) 5. OOmL,分别置于碘f瓶中,准确加入碘溶液
(A2. 3. 3) 10. OmL,再加氢氧化钠溶液(A2.3-4)15. OmL,摇匀,密塞,于暗处反应15min.取出,加硫酸
溶液(A2. 3. 6) 2. OmL,立即用硫代硫酸钠标准溶液(A2.3-2)滴定,直至蓝色刚好消失为其终点.
注:不同稀释倍数,应做相应的空白试验.
A2. 6计算
X= (A-B)c X 90. 05 X 32. 2/5 X 1/2 X二X2
=579.9X(A-B)cXn ..............................(A2)
式中:X—样品的酶活力.u/g(u/mL);
A—空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,mL;
B—样品消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积,mL;
c—硫代硫酸钠标准溶液的浓度,mot/L;
90.05—与1. OOml硫代硫酸钠标准溶液Cc (1 /2Na,S,O,) =1. OOOmol /L〕相当的以克表示的葡萄糖
的质t;
32.2—反应液的总体积,mL;
5—吸取反应液的体积,mL;
1/2—吸取酶液2. OOmL,以1. OOmL计;
.一稀释倍热
2—反应30min,换算成lh的醉活力系数.
所得的结果表示至整数.
7结果的允许差
平行试验相对误差不得超过2%.
蛋白醉
ZrlJ
AAAll定义
lg固体酶粉(或1mL液体酶),在一定温度和pH值条件下,lmin水解酪素产生lkg酪氨酸为一个
醉活力单位,以u/g(u/mL)表示.
Al 2福林法(第一法)
A3.2.1原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下.水解酪素底物,产生含有酚基的氮基酸(如:酪氨酸,色氛酸
QB/T 1803一1993
等),在碱性条件下,将福林试剂(Folin)还原,生成铝蓝与钨蓝,用分光光度法测定,计算其酶活力.
A3.2-2试剂和溶液
A3.2.2-1福林试剂的制备
于2000m1磨口回流装置中加人钨酸钠(Na,WO, " 2H,0)100g,铝酸钠(NaIM00, - 2H,0)25g,水
700m工,85肠磷酸50mL,浓盐酸l00mL,小火沸腾回流10h,取下回流冷却器,在通风橱中加人硫酸锉
(Li2S0,) 50g,水50ml和数滴浓滨水((99写),再微沸15min,以除去多余的澳(冷后仍有绿色需再加滨
水,再煮沸除去过量的嗅),冷却,加水定容至10OOmL.混匀,过滤.制得的试剂应呈金黄色,贮存于棕色
瓶内. 使用溶液:一份福林试剂与二份水混合,摇匀.
A3.2.2.2碳酸钠溶液c (Na,CO,)二0. 4mol/L
称取无水碳酸钠(Na厂O,) 42. 4g,用水溶解并定容至1000mL.
A3.2-2.3三抓乙酸.(CCI, " COOH)=0. 4mol/L
称取三氯乙酸65. 4g,用水溶解并定容至1000mL o
A3.2.2.4氢氧化钠溶液c(NaOH)=0. 5mol/L
按GB 601配制.
A3.2.2.5盐酸溶液c(HCI)=lmol/L及0. lmol/L
按GB 601配制.
A3.2.2.6缓冲溶液
a磷酸缓冲液(pH=7. 5),适用于中性蛋白酶
称取磷酸氢二钠(Na,HP0, 12H,0) 6. 02g和磷酸二氢钠(NaH,PO, 2H,0) 0. 5g,加水溶解并定
容至I OOOmL
b.乳酸缓冲液(pH =3. 0)适用于酸性蛋白酶
甲液称取乳酸(800o-900o)10.6g,加水溶解并定容至10OOmL.
乙液称取乳酸钠((70%)16g,加水溶解并定容至1000mL o
使用溶液取甲液8mL,加乙液1mL,棍匀,稀释一倍,即成0. 05mol/L乳酸缓冲溶液.
c.硼酸缓冲溶液(pH =10. 5)适用于碱性蛋白酶
甲液称取硼酸钠(硼砂)19. 08g,加水溶解并定容至1000mL.
乙液称取氢氧化钠4. Og,加水溶解并定容至1000mL.
使用溶液取甲液500mL,乙液400mL混匀,用水稀释至1000mL,
上述各种缓冲溶液,均须用pH计校正.
A3.2-2.7 log/L酪素11溶液
称取酪素1. OOOg,精确至0. OOlg,用少量0. 5mol/L氢氧化钠溶液(若酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3
滴)湿润后,加人适量的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷
却后,转人100mL容量瓶中,用适宜的pH缓冲溶液稀释至刻度.此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.
注:3)酪索采用上海化学试荆采购供应站经销的试剂.
A3.2-2.8 lOOpg/mL L-酪氨酸.标准溶液
a.称取预先于105 0C干燥至恒重的L-酪氨酸0. 1000g,精确至0. 0002g,用lmol八盐酸60mL溶
解后定容至l OOmL,即为lmg/mL酪氨酸标准溶液.
注:4) L-酪氨酸采用上侮长江生化制药厂产品.
b.吸取lmg/mL酪氨酸标准溶液10. OOmL,用. lmol/L盐酸定容至100mL,即得到l00pg/mL
L一酩氨酸标准溶液.
A3.2.3仪器和设备
A3.2.11恒温水浴400C士0.2 C.
130
QB/'r 1803一1993
分光光度计应符合GB 9721的规定.
分析步骤
标准曲线的绘制
脚441
Al 2
A3.2.
A3.2.
aL-酪氨酸标准溶液:按表A3配制.
表A3
管号
酪氨酸标准溶液的浓度
pg/mL
取100pg/mL酷氨酸标准溶液的体积
mL
取水的体积
m1
012345
010203040
50
0
1
,2 3 4 5
1098765
b.分别取上述落液各1. OOmL k须做半行试验),各加0. 4mol/L碳酸钠溶掖5. OOmL,福林试剂使
用溶液1. OOmL,置于40℃士..2℃水浴中显色20min,取出,用分光光度计于波长680nm,1 Omm比色
皿,以不含酩氨酸的.管为空白,分别测定其吸光度.以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度'为横坐标,
绘制标准曲线(此线应通过零点).
根据作图或用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量如g),即为吸光常数K值其K值
应在95-100范围内.
A3.2-4.2测定
(1)待测酶液的制备
a.称取酶粉1-2g,精确至.. 0002g(或吸取液体酶1. 00ML ),用少量该酶的缓冲液溶解,并用玻
璃棒捣研,然后将上清液小心倾人容量瓶中,沉渣中再添加少量上述缓冲液如此溶解,捣研3-4次,最
后全部移人容量瓶中,用缓冲液定容至刻度,摇匀.用四层纱布过滤,滤液根据酶活力再一次用缓冲液稀
释至适当浓度,供测试用(稀释至被测试液吸光值在..25-0.40范围内)
b.酶粉测定时,稀释倍数参考表A4(液体酶亦可参照表A4稀释).
表A4
酶活单位总倍数第一次稀释第二次稀释
2万20002g-200.L(100倍)5mL- 100mL (20倍)
3万25002g-500.L(250倍)5mL-50mL (10倍)
4万40002g- 200mL (100倍)5mL- 200mL(l0倍)
5万50002g-500mL(250倍)5mL-l00mL (20倍)
8,10万100002g-500.L(250倍)5.L-200mL(40倍)
(2)测定
a.先将酪素溶液放人40'C士.
b.按下列程序操作:
试管A(空白)
4
力u酶液1. OOmL
告40〔,士0. 2 C , 2min
加三氯乙酸2. OOml(摇匀)2'C恒温水浴中,预热5min;
试管B(酶试样
专
,需作三个平行试样)
加酶液1. OOmL
令40C士0. 2 0C, 2min
加酪素1. OOml(摇匀)
Qs/'r 1803一1993
今40'C士0. 2C, `l Omin十40℃士0. 2 0C ,10min
加酪素1. OOmL摇匀)加三氛乙酸2. OOmL摇匀)
今令
取出静止1Omin,过滤取出静止l Omin,过滤
令卡
取l. OOmL渔液取l. OOML谁液
寺告
加破酸钠溶液5. OmL加碳酸钠溶液5. OmL
今十
加福林试剂使用液1. OOmL加福林试剂使用液l. OOmL
去40℃士0. 2 0C显色20min令40℃士.2'C显色20min
于680nm波长,用l Omm比色皿测其吸于680nm波长,用l Omm比色皿测其吸
光度光度
c. 1. 398和166蛋白酸,除反应与显色沮度为30士0.2℃外,其他操作同A3.2.4.2(2),标准曲线
作同样处理.
A3.2.5计算
X二AXKX4/10XnX=2/5XAXKXn. " ", ……(A3)
式中:X一一样品的醉活力,u/g(u/mL)t
A一一样品平行试验的平均吸光度;
K—一吸光常数;
4—一反应试荆的总体积,mLi
10一一反应时间1Omin,以lmin计;
"一一稀释倍数.
所得结果表示至整数.
2.6结果的允许差
平行试验相对误差不得超过3%.
3紫外分光光度法(第二法)
3.1原理
.'.六J伪JIJ
AAA
蛋白醉在一定的沮度与pH条件下,水解酪素底物,然后加人三抓乙酸终止醉反应,并使未水解的
酪素沉淀除去,ta液对紫外光有吸收,可用紫外分光光度法洲定.根据吸光度计算其醉活力.
A3.3.2试剂和溶液
同A3. 2. 2,
A3.3.3仪器和设备
Al I11恒温水浴40℃士0.2`C,
A3.3.3.2紫外分光光度计应符合(;B 9721的规定.
A3.3-4分析步骤
A3.3-4.1录K值
按第一法(A3. 2. 4. la)的表A3配制不同浓度的L-酪氛酸标准溶液,然后,直接用紫外分光光度计
测定其吸光度(A),并计算K值,(其K值应在130^-135范围内).
A3.3-4. 2待测醉液的制备
a.称取酶粉1-2g,精确至.. 0002g(或吸取酶液1. OOmL),以下操作同A3.2.4.2中((1)a;
b.测定酶粉时稀释倍数参考表A5(液体醉亦可参照表A5稀释).
QB/T1803一1993
表AS
醉活单位总倍数第一次稀释第二次稀释
2"5万
8"10万::::19"20OmL(200倍)
19"ZoomL(200倍)
10mL"100mL(10倍)
smL"10omL(20倍)
A3.3.43测定
除酶液吸取2.00mL,酷素吸取2.00mL,三抓乙酸吸取4.00mL外,其它操作条件同福林法测定
(A3.2.4.2)中的反应,静止沉淀,直至过滤.滤液用紫外分光光度计,在275nm波长下,用1omm比色
皿,测定其吸光度(A).
A3.3.5计算
X=AXKXS/ZXI/IOX,XE=2/SXAXKX,XE ……(A4)
式中:x—样品的酶活力,u/g(u/mL);
A一一试样溶液的平均吸光度;
K一一吸光常数;
8—反应试剂的总体积,mL;
2—吸取醉液2.0omL,以lmL计;
1/10—反应时间lomin,以lmin计;
,一稀释倍数,
E—紫外法与福林法的换算系数(中性,碱性蛋白酶系数为0.5.;酸性蛋白酶系数为0.77).
所得结果表示至整数.
A336结果的允许差
平行试验测定值之差不得超过3写.
A4脂肪曲
A4.1定义
19固体酶粉,于4.℃,pH=7.5的条件下,水解脂肪每分钟产生1微摩尔伽mol)的脂肪酸,即为一
个脂肪酶国际单位,以u/9表示.
A4.2原理
脂肪酶在一定条件下,能使甘油三醋水解成脂肪酸,甘油二酷,甘油单酸和甘油,所释放的脂肪酸,
可用标准碱溶液进行中和滴定,用pH计或酚酞指示液指示反应终点,根据消耗的碱量,计算其酶活力.
反应式为:
RCOOH NaOH一RCOONa十H:0
A4.3试剂和溶液
A4.3.1聚乙烯醉(PVA)聚合度1750士50.
A4.32橄榄油5,
注:5)橄榄油采用北京芳草医药公司生产的实脸试荆.
A43.395%(V/V)乙醉(GB679).
A4.34底物溶液的制备
a称取聚乙烯醇(PVA)409,加水800mL,在沸水浴中加热,搅拌,直至全部溶解,冷却后定容至
100omL.以干净的双层纱布过滤,取滤液备用;
h.量取4%PVA溶液(A4.3.4a)150n1L,加橄榄油50mL,用高速组织捣碎机处理6min(分2次
处理,每次3min,中间休息smin),即成乳白色PVA乳化液.该溶液要现用现配.该溶液如贮存在冰
箱中,有效期为一周.
QB/T 1803一1993
A4.3.5 0.025 mol/L磷酸缓冲液(pfl二7.5)
甲液称取磷酸二氢钾(KH2PO,)17.01 9,加水溶解并定容至500 ml
乙液称取磷酸氢二钠(Na,HPO, 12H,O)44.77 g,加水溶解并定容4}. 500 ml.
使用液吸取甲液13 mL,加乙液100 mL,混匀,即成0. 25 mol/1一磷酸缓冲液.使用时用水稀释10
倍,即成.025 mol/L磷酸缓冲液,用pH计校正.
A4. 3. 6 A氧化钠标准溶液'(NaOH)--0.05 mol/L
按GB 601配制与标定'(NaOH)二.. 5 mol/L氢氧化钠标准溶液.使用时,准确稀释10倍.
A4.17 10 g/L酚酸指示液
按CUB 603配制.
A4.4仪器和设备
A4.4.1恒温水浴40℃士0.2c.
A4.4. 2高速组织捣碎机8000^-12000r/min,
A4-4.3 PH计分度值为.02pH单位或2mV,
A4. 4.4电磁搅拌器.
A4. 4. 5微量滴定' 10 mL,分刻度G0. 05 mL,
A4. 5分析步骤
A4. 5.1待测酶液的制备
a称取酶粉1-2g,精确至0. 0002 g,先以少量磷酸缓冲液(A4. 3. 5)溶解,并用玻璃棒捣研,将上
消液小心倾人容量瓶中,沉遭部分再加人少量级冲液,如此反复捣研3-4次,最后全部移人容量瓶中,
用缓冲液定容至刻度,摇匀,转人组织捣碎机捣研3 min后供测定;
b测定酶粉时,稀释倍数参考表A6,控制酶液浓度,样品与对照消耗碱量之差在1-2 ml范围
内.注意:吸取样品时,应将酶液摇匀后再取
表A6
估测酸括力((u/g)稀释倍数
4000600
5000750
6000900
A4.5-2测定
A4.5-2.1电位滴定法(第一法)
a.用pH =9. 22的硼酸钠(硼砂)缓冲液,按pH计使用说明书进行校正仪器;
6.取两个100 mL烧杯,于第一个空白杯(A)和第二个样品杯(B)中各加底物溶液(A4. 3. 4)
4. 00 ml和磷酸缓冲液(A4. 3. 5)5.00 mL,再于A杯中加人95%乙醇(A4.3-3)15. 0 mL,于40℃士0.
2'C水浴中预热5 min,然后于A,B两杯中,各加待侧酶液1. 00 mL,立即混匀计时,在40'C 10. 2℃水
浴中准确反应15 min,于B杯中立即补加95%乙醇15. 0 mL终止反应,取出,
c.在烧杯中放一枚转子,置于电磁搅拌器_L,在搅拌下,用0. 05 MOO氢氧化钠标准溶液滴定.
直至pH =10. 3,为其终点,记录消耗0. 05 mo!/L氢氧化钠标准溶液的体积.
A4.5. 2. 2指示剂滴定法(第二法)
a.取两个100 mL三角瓶,分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中,各加底物溶液(A4.3.4)4.00 mL
和磷酸缓冲液(M.3. 5)5. 00 mL,再于A瓶中加人95环乙醉(A4.3.3)15.0 ml -,于40℃士.2℃水浴
预热5 min,然后,在两瓶中各加待测酶液1. 00 mL,立即混匀计时,在40 C士..2℃水浴中准确反应
QB/T 1803一1993
15 min在13瓶中立即补加95%乙醉15. 0 mL终止反应,取出;
b,于空白和样品溶液中各加酚酞指示液2滴,用..05 mol/L氢缎化钠标准溶液滴定直至微红
色并保持30 s不褪为其终点,记录消耗0. 05 mol/L氢氧化钠标准溶液的体积.
A4.6计算
X二(B-A) X ,/O, 05 X 5O X 1/15 Xn
二200/3X (B-A) X c X n , , , ,. 一(A5)
式中:X-一样品的酶活力,u/K;
B-一一滴定样品时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL;
A-一滴定空白时消耗氢氧化钠标准溶液的体积,mL;
..:一氢氧化钠标准溶液浓度,mot/L;
一氢氧化钠标准溶液浓度换算系数;
50-0. 05 mol/L氢氧化钠溶液1. 00 mL相当于脂肪酸50微摩尔伽mol) ;
1/15-—反应时间15 min,以1 min计;
"-一稀释倍数.
所得的结果表示至整数.
A4.7结果的允许差
平行试验相对误差不得超过2写,
附加说明:
本标准由轻工业部食品工业司提出.
本标准由全国食品发醉标准化中心归口.
本标准由天津轻工业学院,北京市发醉研究所,轻工业部食品发酵工业科学研究所,无锡酶制剂厂,
天津市酶制剂厂负责起草.
本标准由主要起草人:王福荣,郭风茹,田栖静,吴炳炎,侯炳炎
源自：
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