生活饮用水标准检验法（十五）

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30．1．5．1．1　色谱柱：长为2m的玻璃柱或不锈钢柱子。
　　30．1．5．1．2　固定相：80～100目的GDX－103。使用前需在200℃下活化1～2天。  
　　30．1．5．1．3　温度：柱温为160℃；检测器温度为200℃，汽化温度为200℃。  
　　30．1．5．1．4　载气：高纯氮（N2），流速为每分钟45ml。  
　　30．1．5．2　测定  
　　30．1．5．2．1　水样采集及测定  
　　30．1．5．2．1．1　取装有约0．1g抗坏血酸的50ml试管（30．1．3．3），带至现场直接取样。使水样充满全管（不得有气泡），立即用垫有聚四氟乙烯薄膜的反口橡皮塞塞好，至实验室后，用细铁丝将橡皮塞扎紧（若不能当时进行测定，需于冰箱内保存，但不得超过4h）。  
　　30．1．5．2．1．2　将长针头穿透橡皮塞插入管中，使针尖恰好达到50ml标线处，再插入一个注射针头。装置如图9，通人氮气（表压：0．2kgf/cm2），使水样排出至50ml标线处，取下针头。30．1．5．2．1．3　将此管放入40℃水浴中平衡40min。  
　　30．1．5．2．1．4　在保温情况下用50μl注射器从瓶塞处抽取50μl上部气体，注入色谱仪，测定峰高值。  
　　30．1．5．2．2　配制标准系列，需与样品同时配制。  
　　30．1．5．2．2．1　取7个100ml容量瓶各加纯水约97ml，分别加入氯仿标准溶液（30．1．4．2）0、0．20、0．40、0．80、1．20、1．60及2．00ml（浓度各为0、10、20、40、60、80及100μg/L）和四氯化碳标准溶液（30．1．4．3）0、20、40、80、120、160及200μl（浓度各为0、1、2、4、6、8及10μg/L），加纯水定容至100ml。  
　　30．1．5．2．2．2　摇匀后立即倾入装有0．1g抗坏血酸的50ml试管（30．1．3．3），以下步骤按30．1．5．2．1．1～30．1．5．2．1．4　操作。  
　　30．1．5．2．3　绘制校准曲线，从曲线上查出水样中氯仿和四氯化碳浓度。  
　　30．1．6　计算  
　　根据样品中氯仿、四氯化碳的峰高值，直接从校准曲线上查出水样中氯仿、四氯化碳浓度（μg/L）。  
　　若水样经稀释后测定的，需乘以稀释倍数。  
　　31　四氯化碳  
　　同第30章氯仿测定。  
　　32　苯并（a）芘  
　　苯并（a）芘是多环芳烃中有代表性的化合物之一，致癌作用极强，但遇光易分解。因此，水样需用棕色瓶装，采样后尽快分析。  
　　32．1　纸层析－荧光分光光度法  
　　32．1．1　应用范围  32．1．1．1　本法适用于测定生活饮用水及清洁的水源水中苯并（a）芘含量。
　　32．1．1．2　水中含有的一般物质不干扰测定。  
　　32．1．1．3　苯并（a）芘的最低检测量为5．0ng，若取2L水样测定，最低检测浓度为2．5ng/L。  
　　32．1．2　原理  
　　水中多环芳烃能为环己烷萃取并为活化氧化铝所吸附，以苯洗脱浓缩后于乙酰化滤纸上层析，将多环芳烃分离，苯并（a）芘在紫外光照射下呈蓝紫色荧光斑点，取下以丙酮洗脱，其洗脱液的荧光强度与苯并（a）芘含量成正比，可定量测定。  
　　32．1．3　仪器  
　　32．1．3．1　3000ml磨口瓶。  
　　32．1．3．2　2000ml分液漏斗（活塞勿涂油）。  
　　32．1．3．3　层析柱：可用25ml酸式滴定管。  
　　32．1．3．4　KD浓缩器。  
　　32．1．3．5　层析缸：21cm×13cm×30cm。  
　　32．1．3．6　5ml具塞比色管。  
　　32．1．3．7　振荡器。  
　　32．1．3．8　电热磁力搅拌器。  
　　32．1．3．9　254nm紫外分析仪。  
　　32．1．3．10　荧光分光光度计。  
　　32．1．4　试剂  
　　本试验所用的环己烷、丙酮及苯均需重蒸后使用。  
　　32．1．4．1　苯并（a）芘标准贮备液：称取5．00mg苯并（a）芘（C20H12，简称Bap）用少量苯溶解后，加环己烷定容至50．0ml。1．00ml含100μgBap。装入棕色瓶，贮于冰箱内，备用。  
　　32．1．4．2　苯并（a）芘标准溶液：吸取定量的苯并（a）芘贮备液（32．1．4．1）用环己烷稀释至1．00ml含0．10μg Bap。装入棕色瓶，贮于冰箱内，备用。  
　　32．1．4．3　玻璃纤维滤纸。  
　　32．1．4．4　活化氧化铝：取250g100～200目层析用中性氧化铝（Al2O3）于140℃活化4h。冷后装瓶，贮于干燥器内，备用。  
　　32．1．4．5　乙酰化混合液：量取290ml苯，210ml乙酸酐，加入0．11ml浓硫酸，混匀即可。  
　　32．1．4．6　无水乙醇。  
　　32．1．4．7　展开剂：1＋2二氯甲烷－无水乙醇溶液。  
　　32．1．4．8　乙酰化层析滤纸：将7．5cm×27cm的2号层析滤纸30～40张松松卷成圆筒状，逐张放入600ml烧杯中，纸筒中间放一个玻璃熔封的电磁搅拌铁芯，于通风柜中倒入乙酰化混合液（32．1．4．5），将滤纸全部浸泡，于室温（约21℃左右）电磁搅拌反应6h，然后放置至24h，取出滤纸条，自然挥干，再放入乙醇（32．1．4．6）浸泡4h，取出晾至微干，夹入粗滤纸之间，用玻璃板压平至干燥备用。  
　　注：层析滤纸乙酰化反应的时间随室温的高低而适当缩短或延长，如室温约在15℃时，乙酰化时间可延长至40h左右。  
　　32．1．5　步骤  
　　以下步骤需在暗室内、有微弱黄灯下操作。  
　　32．1．5．1　萃取：量取2000ml水样于3000ml磨口瓶（32．1．3．1）中，加入50ml环己烷，置振荡器上振摇5min，放置15min后移入分液漏斗中，分离水相，再加入50ml环己烷，重复萃取一次，合并两次萃取的环已烷溶液（均需从分液漏斗的上口倾出，不得有水进入）。  
　　32．1．5．2　柱层析及浓缩  
　　32．1．5．2．1　氧化铝柱：将活化氧化铝（32．1．4．4）装入底部装有一层玻璃纤维滤纸（32．1．4．3）的25ml滴定管中，高度约为7～10cm，并加入少量环己烷将氧化铝浸润，不得有气泡。  
　　32．1．5．2．2　全部环己烷萃取液通过氧化铝柱，多环芳烃被吸附在氧化铝柱上，未被吸附的其他杂质留在环已烷相中弃去。用20ml苯洗氧化铝柱，收集苯洗脱液。置于KD浓缩器内于60～70℃水浴中减压浓缩至约0．05ml。  
　　32．1．5．2．3　空白和标准：取四份100ml环已烷，其中二份加入0．2ml Bap标准溶液（32．1．4．2），混匀，通过氧化铝柱。按32．1．5．2．2步骤操作浓缩至约0．05ml。  
　　清洁水样，有机物含量低时，柱层析步骤可省略，即将水样的环己烷萃取液直接于KD浓缩器内浓缩至约0．05ml。空白和标准亦同样操作。  
　　32．1．5．3　纸层析　32．1．5．3．1　点样：在乙酰化层析滤纸下端3cm处，用铅笔轻轻划一横线，横线两端各留出1．4cm，以2．3cm间隔点样。用玻璃毛细管（自制）依次点空白、标准及水样的浓缩液（32．1．5．2．3及32．1．5．2．2）。斑点直径不要超过3mm，为防止斑点扩散，点样过程中可用冷风吹干溶剂。平行样分别点两张层析滤纸。  
　　32．1．5．3．2　层析：将已点样的滤纸悬挂在装有约2cm高的1＋2二氯甲烷－乙醇展开剂（32．1．4．7）的层析缸中的玻璃架上。纸条下端浸入展开剂1cm深处，用透明胶纸密封层析缸，避光展开约20cm，取出纸条于暗处挥发干。  
　　32．1．5．4　将已层析过的滤纸置紫外分析仪（32．1．3．9）中观察，用铅笔划出与蓝紫色Bap标准斑点同高度的空白及水样斑点范围。剪下并剪成细条放入比色管中加入4．0ml丙酮，盖严，用手或振荡器振摇1min。倾出丙酮洗脱液。  
　　32．1．5．5　测定相对荧光强度：将丙酮洗脱液，装入1cm石英皿中，于激发波长为385nm下，分别测定发射波长为402、405、408nm处的荧光强度。  
　　32．1．6　计算  33　滴滴涕
　　滴滴涕和六六六（666）均系有机氯杀虫药剂，在水中性质稳定，并具有臭味。  
　　33．1　气相色谱法  
　　33．1．1　应用范围  
　　33．1．1．1　本法采用电子捕获鉴定器，可分离鉴定滴滴涕和666的各种异构体。适用于测定生活饮用水及其水源水中有机氯农药的含量。  
　　33．1．2　原理  
　　水中有机氯农药经有机溶剂萃取浓缩后，由氮气载入色谱柱进行分离，载有有机氯农药的氮气进入电子捕获鉴定器，其出峰顺序为：  
　　①α—666；②Υ－666；③β－666；④δ－666；⑤o，p－DDE；⑥p，P－DDE；⑦o，p－DDT；⑧p，p－DDD；⑨p，p－DDT。  
　　电子捕获鉴定器中具有一个放射源（3H或63Ni）的电离室，其β射线可使氮电离，并产生自由电子。向电离室正极施加电压，移动速度较快的自由电子形成恒定的电源。当氮气将有机氯农药载入电离室时，与自由电子反应形成负离子，导致电流量的降低，根据电流量的改变进行定量分析。  
　　33．1．3　仪器所用玻璃器皿均需经铬酸洗涤液浸泡。  
　　33．1．3．1　具电子捕获鉴定器的气相色谱仪  
　　固定相：3％OV－210（或QF－1）加0．5％OV－17固定液的Chromosorb W 酸洗硅烷化担体80～100。  
　　色谱柱：长2m，内径3mm的玻璃管。  
　　温度：镍源鉴定器柱温：185℃，气化室：250℃，鉴定器：225℃；氘源鉴定器柱温：180℃，气化室：220℃，鉴定器：195℃。  
　　33．1．3．2　1000ml分液漏斗。  
　　33．1．3．3　10ml具塞比色管。  
　　33．1．3．4　5μl微量注射器。  
　　33．1．4　试剂33．1．4．1　滴滴涕，666标准贮备溶液：称取α－666，β－666，Υ－666，δ－666和o，p－DDE，p，p－DDE，o，p－DDT，p，p－DDD，p，p－DDT各10．0mg，分别置于10ml容量瓶中，用苯溶解并稀释至刻度。  
　　33．1．4．2　滴滴涕、666标准溶液：用环己烷将标准贮备液分别稀释100倍，使各成为1．00ml含10．0μg的中间浓度溶液。  
　　33．1．4．3　滴滴涕、666混合标准溶液：分别吸取33．1．4．2标准溶液：α－666、γ－666各0．10ml，δ－6660．2ml、β－666、o，p－DDE、p，p－DDE各0．50ml，o，p－DDT、p，pDDD、p，p－DDT各1．00ml，合并于10ml容量瓶中，加环己烷至刻度，摇匀。混合标准液1．00ml含α－666、Υ－666各0．10μg，δ－6660．20μg，β－666、o，p－DDE、p，p－DDE各0．50μg，o，p－DDT、p，p－DDD、p，p—DDT各1．00μg。根据仪器的灵敏度，用环己烷将此混合标准液再稀释成标准系列，贮存于冰箱中。  
　　33．1．4．4　苯：色谱纯。  
　　33．1．4．5　环己烷：重蒸馏。  
　　33．1．4．6　硫酸：优级纯。  
　　33．1．4．7　无水硫酸钠：分析纯，经350℃灼烧4h，贮存于密闭容器中。  
　　33．1．4．8　4％硫酸钠溶液：称取4g无水硫酸钠（33．1．4．7），溶于纯水中，稀释至100ml。  
　　33．1．5　步骤  
　　33．1．5．1　萃取和净化  
　　33．1．5．1．1　洁净的水样：取水样500～1000ml，置于1000ml分液漏斗中，加入10．0ml环己烷（33．1．4．5），充分振摇3min，静置分层，弃去水相。环己烷萃取液经无水硫酸钠（33．1．4．7）脱水后，供测定用。  
　　33．1．5．1．2　污染较重的水样：取水样500～1000ml，置于1000ml分液漏斗中，加入10．0ml环己烷（33．1．4．5），振摇3min，静置分层，弃去水相。加入2ml硫酸（33．1．4．6），轻轻振摇数次，静置分层，弃去硫酸相。加入10ml 4％硫酸钠溶液（33．1．4．8），振摇数次，分层后，弃去水相。环己烷萃取液经无水硫酸钠（33．1．4．7）脱水后，供测定用。  
　　33．1．5．2　吸取上述萃取液5．0μl注入色谱柱内，记录色谱峰，从标准曲线中分别查出滴滴涕和666各异构体的浓度。  33．1．5．3　标准曲线的绘制：分别吸取混合标准溶液（33．1．4．3）5．0μl，注入色谱柱，以测得的峰高或面积为纵坐标，各单体滴滴涕和666的浓度为横坐标，分别绘制校准曲线。35　细菌总数
　　细菌总数是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。  
　　35．1　平板法  
　　35．1．1　应用范围  
　　35．1．1．1　本法适用于测定饮用水和水源水中的细菌总数。  
　　35．1．1．2　所测定的细菌总数增多说明水被生活废弃物污染，但不能说明污染的来源。因此必须结合总大肠菌群数来判断水污染的来源和安全程度。  
　　35．1．2　原理  
　　每种细菌都有它一定的生理特性，培养时应用不同的营养条件及其他生理条件（如温度、培养时间、pH、需氧性质）去满足其要求，才能分别地将各种细菌培养出来。在实际工作中，不可能做到。一般是根据测定要求而采用常用方法进行细菌总数的测定，所测定的结果，只包括在所使用的条件下生长的细菌总数。  
　　35．1．3　仪器  
　　35．1．3．1　高压蒸汽灭菌器。  
　　35．1．3．2　干热灭菌箱。  
　　35．1．3．3　恒温箱。  
　　35．1．3．4　冰箱  
　　35．1．3．5　放大镜。  35．1．3．6　试管、平皿（直径9cm）、刻度吸管等，置于于热灭菌箱中160℃灭菌2h。
　　35．1．4　培养基
　　35．1．4．1　成分：

　　蛋白胨　　　　 10g
　　牛肉膏　　　　　3g
　　氯化钠　　　　　5g
　　琼脂　　　 10～20g
　　蒸馏水　　　1000ml

　　35．1．4．2　制法
　　将上述成分混合后，加热溶解，调整pH为7．4～7．6，过滤，分装于玻璃容器中，经121℃灭菌20min，储存于冷暗处备用。
　　35．1．5　步骤
　　35．1．5．1　生活饮用水
　　35．1．5．1．1　以无菌操作方法用灭菌吸管吸取1ml充分混匀的水样，注入灭菌平皿中，倾注约15ml已融化并冷却到45℃左右的营养琼脂培养基，并立即旋摇平皿，使水样与培养基充分混匀。每次检验时应做一平行接种，同时另用一个平皿只倾注营养琼脂培养基作为空白对照。
　　35．1．5．1．2　待冷却凝固后，翻转平皿，使底面向上，置于37℃恒温箱内培养24h，进行菌落计数，即为水样1ml中的细菌总数。
　　35．l．5．2　水源水
　　35．1．5．2．1　以无菌操作方法吸取1ml充分混匀的水样，注入盛有9ml灭菌水的试管中，混匀成1：10稀释液。
　　35．1．5．2．2　吸取1：10的稀释液1ml注入盛有9ml灭菌水的试管中，混匀成1：100稀释液。按同法依次稀释成1：1000、1：10000稀释液等备用。吸取不同浓度的稀释液时必须更换吸管。
　　35．1．5．2．3　用灭菌吸管取2～3个适宜浓度的稀释液1ml，分别注入灭菌平皿内。以下操作同生活饮用水的检验步骤。
　　35．1．6　菌落计数及报告方法
　　作平皿菌落计数时，可用眼睛直接观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平皿的菌落数后，应求出同稀释度的平均菌落数，供下一步计算时应用。在求同稀释度的平均数时，若其中一个平皿有较大片状菌落生产时，则不宜采用，而应以无片状菌落生产的平皿作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌落不到平皿的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半皿计数后乘2以代表全皿菌落数。然后再求该稀释度的平均菌落数。
　　35．1．7　各种不同情况的计算方法
　　35．1．7．1　首先选择平均菌落数在30～300之间者进行计算，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则即以该平均菌落数乘其稀释倍数报告之（见表18例1）。
　　35．1．7．2　若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300之间，则应按两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于2应报告两者的乎均数，若大于2则报告其中较小的菌落总数（见表18例2及3）。
　　35．1．7．3　若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表18例4）。
　　35．1．7．4　若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表18例5）。
　　35．1．7．5　若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，则以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表18例6）。
　　35．1．7．6　菌落计数的报告：菌落数在100以内时按实有数报告，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算，为了缩短数字后面的零数也可用10的指数来表示（见表18“报告方式”栏）。在报告菌落数为“无法计数”时，应注明水样的稀释倍数。
                                    
                  
              
            
            
              
            
            
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